化學(xué)修飾法測序原理

化學(xué)試劑處理末段DNA片段，造成堿基的特異性切割，產(chǎn)生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳分離?；瘜W(xué)切割反應(yīng)：包括堿基的修飾，修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去在失去堿基的糖環(huán)處DNA斷裂。

Sanger法測序的原理

就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。

DNA測序的規(guī)律

生成互相獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點(diǎn)，但卻隨機(jī)終止于特定的一種或者多種殘基上。

由于DNA上的每一個(gè)堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會(huì)均等，因此上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。

在可以區(qū)分長度僅差一個(gè)核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個(gè)相鄰的泳道上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。